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[자연과학]생화학실험 - Peptide Mass Fingerprinting Ⅱ [MALDI - TOF] 다운

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[자연과학]생화학실험 - Peptide Mass Fingerprinting Ⅱ [MALDI - TOF]

1. 실험제목: Peptide Mass Fingerprinting

Ⅱ (MALDI - TOF)

2. 실험일자:

3. 제출자 :

4. 목적 : MALDI - TOF　의 원리와 사용법을 익히고 이해한다.
지난 실험의 결과로 얻은 peptide sample을 분석해본다.

5. 원리:

1. Mass spectrometry

질량분석기는 질량과 전하의 비율을 측정함으로써 분자의 질량을 측정한다.
질량분석기에 의한 분자량 측정은 분자이온의 생산, 분리, 그리고 탐지에 기본을 둔다.
질량분석기를 이용한 측정은 이온화된 분석물질의 가스상태에서 수행된다.
질량분석기는 ion source, mass analyzer, detector로 구성된다.
Ion source에서는 sample을 이온화시키는데, ESI(Electrospraty ionization)와 MALDI가 일반적으로 사용된다.
ESI는 용액으로부터 분석물질을 이온화시키고 용액을 바탕으로 하는 분리도구에 쉽게 연결된다.
MALDI - TOF는 laser 진동을 통해 크리스탈화된 matrix 샘플을 승화시키고 이온화한다.
Analyzer에서는 m/z 비율에 따라 ion을 분리한다.
분석 타입에는 ion trap, time-of-flight, quadrupole, FT-MS 분석기 등이 있다.
Detector에서는 현재 이온을 모니터링하고, 그것을 증폭시킨다.
그리고 그 signal은 mass spectrum 형식으로 기록되는 데이터 시스템에 전송된다.
이온들의 m/z 값은 샘플내의 수많은 구성성분들과 각각의 구성성분의 분자량과, 그리고 샘플 내에 다양한 구성성분의 상대적 존재도를 보여주기 위한 강도들로 구성된다.
일반적인 것들로는 광전자 photomultiplier, electron multiplier 그리고 micro-channel plate detector이다.

2. MALDI-TOF

간단한 단계 질량분석기들은 peptide mass mapping 기술에 의해 큰 규모의 protein 동정을 위해 수많은 프로젝트들에 사용됐던 도구들이다.
이 방법은 더 작고 완전히 시퀀스된 게놈들에 여러 종들로부터 단백질들의 동정을 위해 특히 쓰여진다.

a. MALDI: 버퍼들과 다른 부가물들에 잘 견디고 사용하기에 수월하다.
대부분 현대 도구들은 샘플 분자량의 0.01% 안의 오차범위로 질량을 측정하는 능력이 있다.
MALDI-TOF는 샘플을 이온화시키기 위해 레이저빛과 함게 샘플 분자들의 충격을 기본으로 한다.
샘플은 일관되고 신뢰성 있는 결과를 위해 matrix 화합물과 함께 미리 섞어진다.
대부분의 상업적으로 가능한 질량분석기들은 337nm 파장의 규칙적으로 전해진 질소 laser를 가진다.
MALDI-TOF는 분자량에 관계없이 하나의 전하를 가진 분자관련 이온들의 생산에 탁월한 결과가 나온다.

b. matrix: 매트릭스 물질의 크리스탈은 분석하는 동안 분자의 이온화에 도움을 준다.
매트릭스는 분석 물질과 함께 용액 내에서 잘 녹아야하며, laser 파장을 효과적으로 강하게 흡수시킬 수 있어야 한다.
또한 분석물질과 화학적인 반응이 없어야 한다.

c. + 이온화모드에서 비록 그것들이 salt 부가물들, 대략 m/z 값의 반이 되는 부분에 두 개의 전하를 띈 분자 이온의 자취, 그리고 대략 두 배의 m/z 값이 2량체 종류들의 자취에 의해 조화될 수 있지만, 수소화된 분자 이온들은 일반적으로 주요한 종류이다.
+ 이온화는 단백질과 peptide 분석을 위해 일반적으로 사용된다.
이온화는 올리고뉴클레오티드와 올리고당의 분석을 위해 사용될 수 있다.
만약 샘플이 수소를 잘 받아들이는 기능기들을 가지고 있다면 + 이온 관측이 사용되며, 샘플이 수소를 잘 잃어버리는 기능기를 가지고 있다면 -이온 관측이 사용된다.

d. TOF: time-of-flight 질량 분석기는 간단한 질량 분리 이론을 기본으로 한다.
가벼운 이온들은 디텍터에 더 빠르게 흐르고 무거운 이온들은 더 천천히 흐른다.
즉 이온들은 그것들의 m/z 비율에 따라 분리된다.
MALDI-TOF에 의해 생산되는 이온들은 움직이지 않는 전계에서 가속한 후에 퍼진 넓은 에너지를 표시한다.
field-free 영역에 이온들이 형성됨으로써 그리고 이온들을 가속화하기 위한 미리 결정된 시간 연장 이후에 높은 전압의 충격을 사용함으로써 에너지 퍼짐이 줄어들 수 있다.

e. measurement of TOF

m/z = (MW + nH+)/n

f. Feature of TOF

① Linear & reflect mode

② Delayed Extraction: 이온은 field-free region을 형성하고 high voltage pulse에 의해 방출된다.

③ Vacuum System: 높은 진공 환경을 통해서 다른 영향에 의한 이온의 이동 방해를 최소화한다.

g. TOF calibration

질량 분석기의 m/z 값을 알려진 샘플에 의하여 보정시킨다.

6. 시료 및 기자재:　

시료- a-cyano-4-hydroxycinnamic acid, Deionized water, Acetonitrile(ACN), 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) in deionized water, acetone, matrix solution, 50% acetonitrile(500㎕) +0.1% TFA(1㎕) buffer + DW 499㎕, desalt solution

buffer A- 100% ACN, B- 50% ACN, C- 0% ACN (D.W. 100%)

실험도구- Analytical balance, 1.5ml microcentrifuge tubes, microcentrifuge, micropipettor and disposable tips, vortex mixer, sonicator, zip-tip, sample plates

7. 실험방법

-Desalting Method

1) sample을 C18 ZipTip에 4~5회 pipetting 한다.

2) 20㎕ 0.1TFA로 2~3회 pipetting 한다.

3) 3㎕ Matrix solution (in 50% ACN)으로 elution한다.

(이 때 직접 MALDI plate 에 Loading)

-Standard Loading

1) Standard + Matrix tube에서 0.5㎕씩 loading

8. 실험결과

9. 고찰

이번 주 실험은 MALDI-TOF 기계를 이용하여 지난주 실험을 수행한 결과로 얻은 미지 peptide fragment를 알아내는 것이었다.
교재에는 실험 과정이 길게 나타나 있지만 matrix와 sample plate cleaning은 조교님께서 미리 준비해주셨기 때문에 실제로 우리가 실험할 것은 sample preparing 뿐이었다.
Sample preparing의 과정은 우선 Zip tip 에 sample을 pipetting하여 peptide를 zip tip 내부의 resin 에 loading 한다.
ziptip내부에는 agarose가 있는데 , peptide와 hydr… 다운



..... (중략)






제목 : [자연과학]생화학실험 - Peptide Mass Fingerprinting Ⅱ [MALDI - TOF] 다운
출처 : 지식114 자료실



[문서정보]

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키워드 : 자연과학,생화학실험,Peptide,Mass,Fingerprinting,MALDI,TOF



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