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[의학,약학] [분자생물학] DNA 염기서열 분석방법 (파일첨부)

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[의학,약학] [분자생물학] DNA 염기서열 분석방법

분자생물학자들이 수행하는 가장 중요한 기술은 DNA 조각을 정확히 염기 배열하는 DNA 염기서열 결정법일 것이다.
DNA 염기서열 결정법은 30여 년간 발전 및 이용되어왔으나, 1970년대 후반에 들어서야 빠르고 효과적인 염기서열 결정이 가능케 되었다.

그 중 대표적인 방법이 영국의
F. Sanger가 개발한 사슬 종결법(chain termination method)이다.
Sanger method는 고전적인 염기 서열 분석 방법으로 약 30여년간 Sanger method는 DNA염기서열 결정 방법의 표준이 되어 왔다.

이 기술은 DNA 합성 기작에 그 기초를 둔다.
서열을 분석할 DNA의 단일가닥 부위가 주형(template)으로 사용되며 dideoxyNTP를 이용하여 chain을 termination시켜 DNA 사슬의 연장을 특이적으로 종료시키는 기술이다.

`고전` 이라고는 하나 여전히 정확도나 Read Length 면에서 Sequencing의 Gold Standard 로 통하며, Genomics 쪽에서의 활용도는 아무래도 줄어들겠지만 일반적인 연구용의 Sequencing 방법으로써는 여전히 건재하다.

하지만 Sanger method는 Human Genome Project와 같은 광범위한 염기서열 분석에 사용하기에는 극복하기 어려운 시간 및 비용의 한계를 지니고 있었다.
이러한 비용절감 및 빠른 시간에 대한 요구에 의해 Solexa, SoLiD, Pyrosequencing과 같은 여러 가지 차세대 염기서열분석 기술이 등장하게 되었다.

특히 Pyrosequencing은 read length가 가장 길고 소요되는 시간이 가장 짧아 적은 양으로 빠른 시간에 sequencing이 가능한 장점이 있어 최근 차세대 염기서열 분석 (Next Generation Sequencing)의 중심 기술로 각광을 받고 있다.

Roche 그룹의 일원인 454 Life Science에서 개발한 염기서열 분석 기술로서 일반적으로 Pyrosequencing 이라 함은 454 Sequencing을 칭한다.

Sanger법과 달리 ddNTP를 사용하지 않고 DNA를 합성하는 동안 생성되는 부산물인 Pyrophosphate(PPi)를 사용한 기술로 “sequencing by synthesis\" 원리를 기초로 한 염기서열 분석방법이다.
유전자를 구성하고 있는 4개의 염기 (A, T, G, C)에 각각 다른 형광표지를 붙여 실시간으로 유전자의 염기서열을 밝혀내는 기술로 Enzyme cascade(효소연쇄반응)를 응용, 나타나는 빛을 검출하여 데이터화 한다.
Read Length 가 다른 방법에 비해서 상대적으로 길어 다양한 연구에 사용이 가능하지만, 한번 운용하는데 사용되는 비용이 Solexa나 SoLiD에 비해 굉장히 비싸다는 단점 또한 가지고 있다.

- Pyrosequencing의 과정

그렇다면 이러한 Pyrosequencing은 어떤 과정을 통해 이루어질까

Pyrosequencing은 전체 genome을 염기서열 분석을 수행하기에 적당한 크기로 잘라주는 DNA Library preparation 과정과 emulsification을 통해 수백만 개의 미세반응계(micro-reactor)들을 만들고 이로부터 clonal DNA library를 만들기 위한 emPCR 과정 그리고 만들어진 clonal DNA들에 대하여 염기서열 분석 반응을 수행하는 Sequencing 과정으로 이루어진다.
즉, Library preparation 과정과 emPCR을 통한 Template preparation 과정을 통해 시료를 준비하고 이를 Sequencing 한다.

PTP well에 준비된 emPCR비드와, 염기서열 분석에 필요한 각종 효소를 수반하는 Enzyme bead를 채워줌으로써 시료 준비가 완료된다.

- Pyrosequencing의 원리

준비된 시료를 이용하여 염기 서열을 Sequencing 한다.
그 과정을 정리하면 다음과 같다.
DNA elongation에 dNTP 이용시 생성되는 PPi를 ATP sulfurylase가 APS에 붙여주어 ATP를 형성하고, 이것을 luciferase가 이용해서 luciferin이 빛이 나도록 한다.
만약 그 서열에 맞지 않은 dNTP를 첨가하면 이것이 분해되도록 apyrase와 같은 효소를 통해 상보적이지 않은 dNTP를 분해시키는 작업을 한다.

이러한 작업을 반복해서 sequencing 하는 방법이 pyrosequencing이다.

각 단계별로 이를 살펴보자.

: DNA합성중에 PPi(Pyrophosphate)가 부산물로 생성된다.

: PPi는 ATP-sulfurylase에 의해 APS와 반응하여 ATP를 생성한다.

: ATP는 Luciferase를 활성화 시켜 Luciferin으로 산화시킨다.
이때 빛이 발생한다.

: 이 때 이 발산되는 빛을 CCD camera를 통해 검출, 인식하게 된다.

1) 특정염기마다 반응 후의 빛이 제각기 다르다는 것으로 각 염기를 구분 할 수 있으며,

2) 빛의 세기는 염기의 양과 비례함을 이용, 동일한 염기가 연속적일 때를 확인 가능하다.

사용되고 남은 dNTP와 ATP는 Apyrase에 의해 분해된다.

Pyrosequencing을 통한 염기서열 분석 시 긴 염기서열은 분석이 어렵기 때문에 DNA를 여러 조각을 내서 분석한다.
따라서 적은 양으로 빠른 시간에 sequencing이 가능한 장점이 있다.

- Pyrosequencing의 응용

Pyrosequencing은 Read Length가 길기 때문에, 가장 다양한 연구에 활용이 가능하다.
유전자가 지닌 변이 양상을 그대로 대변하거나, 미세한 양으로 존재하는 DNA변이를 정확히 확인한다든지 하는 일은 충분한 Read Length를 확보한 경우에 정확한 분석이 가능하다.
또한 전사체로부터 얻은 유전자 정보를 정확히 해독하는 일, 특히 미생물 다양성을 연구하기 위한 양질의 정보를 얻기 위해서는 오직 Pyrosequencing 또는 Sanger method를 통해서 가능하다고 평가 되고 있다.
Pyrosequencing의 주요 응용 분야에 대해 살펴보면 다음과 같다.

1. De novo sequencing

Pyrosequencing은 400 bp 정도의 긴 read sequence를 이용하여 염기서열을 조합하기 때문에, 짧은 read sequence들을 지닌 분석 기술들에 비하여 훨씬 적은 수의 gap을 발생시키며, 따라서 이어지는 작업에 있어 훨씬 적은 노력이 필요하다.
또한 전체적으로 5배에서 10배 정도 적은 coverage로도 충분한 결과를 얻을 수 있는 것으로 평가 되고 있다.

2. Whole genome re-sequencing

400 bp라는 긴 read는 re-sequencing에 있어서도 repeat region을 확인 하는데 매우 유용하게 쓰일 수 있을 것으로 평가 되고 있으며, 높은 정확도로 인해 reference sequence에 대비하여 걸러지는 양이 크지 않을 것으로 평가한다.
더욱이 이러한 긴 read와 다양한 jumping distance를 활용한 Long Paired End Sequencing으로 Human Genome에서 insertion, deletion, CNV 등과 같은 structural variation을 분석하는 것에도 유용하게 사용될 수 있다.

3. Am… (파일첨부)



..... (중략)






제목 : [의학,약학] [분자생물학] DNA 염기서열 분석방법 (파일첨부)
출처 : 지식114 자료실



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키워드 : 의학,약학,분자생물학,DNA,염기서열,방법,분석방법



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